荧光增白剂和的物理化学性质及细胞毒性(2)

1.5 细胞凋亡实验

通过研究与荧光增白剂作用后的细胞凋亡情况,可充分反映荧光增白剂对细胞是否会产生急性或慢性毒性。首先我们将16HBE和HaCaT细胞被分别接种在6孔板中,细胞接种密度为5×104个,分别使用RPMI-1640和DMEM完全培养基进行培养,然后将所有的孔分成4组,每组平行3个孔。4个组分别为:对照组、50 μg/ml荧光增白剂组、100 μg/ml荧光增白剂组,200 μg/ml荧光增白剂组。当六孔板中的细胞密度长到80%时,各个荧光增白剂组分别与对应浓度的材料孵育24 h,然后将绿色荧光标记的Annexin Ⅴ和PI工作液加入到六孔板中,染色1 h,绿色荧光标记的Annexin Ⅴ可以与细胞膜外翻后暴露的磷酯酰丝氨酸结合,反映细胞早期和晚期凋亡情况,可产生红色荧光的PI可以穿过破坏的细胞膜进入细胞核,和染色质结合,反应细胞晚期凋亡情况。将细胞消化、离心洗涤3次,弃掉游离的绿色荧光标记的Annexin Ⅴ和PI,使用流式细胞仪检测细胞不同荧光的强度,绿色荧光代表细胞发生早期凋亡、红色荧光代表细胞发生晚期凋亡。Q1-LL区域代表正常细胞,Q1-LR区域代表早期凋亡细胞,Q1-UR代表晚期凋亡细胞,Q1-UL区域代表坏死细胞。

2 结果

2.1 荧光增白剂的物理化学性质

荧光增白剂CBS和CXT及其不同剂型的衍生物的分子式见图1。我们分别对其消光系数、棉布增白强度、含水量、水不溶物、色谱纯度和Zeta电势进行了检测,检测结果见表1。

图1 荧光增白剂CXT和CBS及其不同剂型的分子结构式Figure 1 The formula of fluorescent brighteners CXT and CBS

表1 荧光增白剂CXT和CBS的物理化学参数Table 1 The physicochemical parameters of fluorescent brighteners CXT and CBS荧光增白剂消光系数(a.u.)增白强度(%)水分(%)水不溶物(≤0.2%)色谱纯度(%)Zeta电势(mV)目视合格 .921.6目视合格

从表1中可以看出,实验选取的两种荧光增白剂各项指标均符合产品出厂的各项检测指标,色谱纯度均在95%以上,对棉布的增白强度也都达到了99%以上,具有良好的染色效果。Zeta电势结果显示,CXT和CBS荧光增白剂的电势-23.8 mV和-13.8 mV。荧光增白剂CBS和CXT从水溶液中析出后,显微镜图片显示CBS其呈块状、大小尺寸不一,但具有明显的晶体结构(见图2A)。CXT呈均匀细小的粉末状,无明显的晶体结构(见图2B)。扫描电子显微镜图片显示,荧光增白剂CBS为众多细小的薄片层状结构堆积形成的团块结构(见图2C),荧光增白剂CXT为小颗粒和大块状材料的混合体,但是整体的尺寸要明显小于荧光增白剂CBS(见图2D)。动态光散射仪结果显示荧光增白剂CBS溶液的水合粒径约为136.6 nm(见图3A),CXT溶液的水合粒径约为122.3 nm(见图3B)。

A.荧光增白剂CBS粉末的显微镜成像 B.荧光增白剂CXT粉末的显微镜成像 C.荧光增白剂CBS粉末的扫描电子显微镜成像 D.荧光增白剂CXT的SEM成像图2 荧光增白剂CBS和CXT的形貌Figure 2 Morphology of fluorescent brighteners CBS and CXT

A.荧光增白剂CBS的水合粒径 B.荧光增白剂CXT的水合粒径图3 动态光散射仪检测荧光增白剂CBS和CXT溶于水后的粒径分布Figure 3 The size distribution of fluorescent brighteners in water by dynamic light scattering

2.2 荧光增白剂的细胞毒性结果

细胞活力研究结果显示16HBE和HaCaT细胞有着浓度依赖效应的毒性(见图4)。但这两种细胞的耐受性还是有明显的区别,对于荧光增白剂CBS,当其浓度达到100 μg/ml时,16HBE细胞的细胞活力下降到了80%左右;而对于荧光增白剂CXT,当其浓度达到100 μg/ml时,16HBE细胞的细胞活力下降到了90%左右。而相对于HaCaT细胞,当荧光增白剂CBS和CXT浓度均达到600 μg/ml时,其细胞活力下降到了80%左右。

我们使用显微镜观察了细胞形态结构的变化,发现在与200 μg/ml浓度的CBS和CXT作用24 h后,除极少量细胞死亡悬浮的培养液的上层,大部分的细胞形态并未发生明显改变(见图5)。

图4 不同浓度荧光增白剂CBS和CXT对16HBE和HaCaT细胞活力的影响Figure 4 The cell viability of 16HBE and HaCaT cells after cultured with various concentrations of fluorescent brighteners for 24 h

A.16HBE细胞正常形态;B.16HBE细胞与200 μg/ml荧光增白剂CBS溶液作用24 h;C.16HBE细胞与200 μg/ml荧光增白剂CXT溶液作用24 h;D.HaCaT细胞正常形态;E.HaCaT细胞与200 μg/ml荧光增白剂CBS溶液作用24 h;F.HaCaT细胞与200 μg/ml荧光增白剂CXT溶液作用24 h图5 荧光增白剂CBS和CXT对16HBE和HaCaT细胞形态结构的影响Figure 5 The morphology of 16HBE and HaCaT cells after incubation with fluorescent brighteners CBS and CXT

流式细胞仪联合凋亡试剂检测结果显示,无论是对于16HBE细胞还是HaCaT细胞,荧光增白剂CBS和CXT浓度即使达到200 μg/ml,也均未诱导细胞凋亡(见图6-9)。

文章来源：《中国药理学与毒理学杂志》 网址: http://www.zgylxydlxzz.cn/qikandaodu/2021/0303/524.html