肠道青春双歧杆菌体外传代稳定性研究(2)

研究双歧杆菌代谢产物中主要脂肪酸乙酸、乳酸以及它们的比值与传代关系,可以发现随着传代的增加,培养液中代谢物乳酸含量增加,而乙酸变化不明显,两者比例第10代下降显著。图2显示新分离细菌图中主要为乳酸与琥珀酸的波峰,出峰时间分别在8.3min和12min;传代10代以后,谱形未发生变化,出峰时间亦相同。图3显示新分离(左)及传代10代(右)的青春双歧杆菌代谢产物中VFA的气相色谱图,波谱基本相同,主要为乙酸波峰,出峰时间约在10min。

2.4?青春双歧杆菌电镜形态?在扫描电镜下观察,新分离双歧杆菌形态为杆状,表面光滑,形态规则,可见少量分叉,呈T型或Y型;传代10代后菌体明显变短,大小不一,分叉减少,但表面未发现明显改变。透射电镜下观察显示胞壁完整,胞内结构清楚,新分离菌体可见分歧状结构,未发现鞭毛,也无病毒颗粒及支原体;传代10代后菌体明显变粗短,分歧消失,但胞壁及胞内结构物改变。如图4。

2.5?青春双歧杆菌的G+C比例变化?图5为不同传代数青春双歧杆菌的热解链温度值,横坐标为温度,纵坐标为在280nm波长下的吸光度,三个图形基本相似,根据复性速率法(Tm值法)值计算(G+C)mol%无明显变化。

3?讨论

1989年Fuller明确了益生菌的作用和标准,益生菌应当是能够促进肠内菌群生态平衡对宿主起有益作用的活的微生物制剂,并规定其必须具有存活能力和稳定性。青春双歧杆菌调节肠道菌群并能抑制致病菌的生长虽然已经被广泛认同,但是一株菌株要进入药用生产,除了要进行药效学、药理学、毒理学试验,还必须对传代稳定性进行研究[3,4]。在实验室进行的研究最终的目的是为了能应用于临床,因此,菌株的传代稳定性也是考察其是否具有药用价值的关键。

为了更加系统的研究双歧杆菌传代稳定性,对所分离的青春双歧杆菌用MRS培养基进行培养多次传代繁殖,从形态学、生化学、代谢物特点以及核酸组成方面探讨了传代繁殖对于双歧杆菌的影响。MRS是双歧杆菌的常用培养基,对双歧杆菌生长影响小,可以保证实验的真实性和可重复性,而且配方价格相对便宜,可用于较大规模的生产。

从形态学研究来看,随着双歧杆菌培养传代次数的增加形态逐渐发生改变,首先表现在其外形方面,菌体从第五代开始变短变粗,分叉开始有消失。但革兰染色仍然呈均匀紫红色,电镜下面观察双歧杆菌菌体较刚分离时粗短,仍可见分叉,表面光滑,内部结构无变化。从第十代开始,菌体形态变得更加短小,而且染色也呈现不均匀,表现在菌体两端染色较深,中间呈浅红色,革兰染色有呈阴性转化趋势。在电镜下面菌体变粗短,表面仍光滑,但分叉基本消失。虽然培养基环境对双歧杆菌影响小,但是与体内环境毕竟不同,首先表现在培养基营养条件丰富,并含有双歧杆菌促生长因子,因此造成双歧杆菌形态学发生改变可能与培养基条件有关。在培养基条件下,双歧杆菌成熟时间变短、繁殖加快可能是造成菌体变短小的原因。

在考察培养传代双歧杆菌生化反应中,检测了20种底物的生化反应,结果表明各代对于反应底物的生化作用无明显变化,在对棉子糖反应的显色强度从十二代以后有所减弱,而对于关键糖的反应如松三糖、甘露醇与新分离菌基本相同。说明传代繁殖对于双歧杆菌的生化无明显影响,只有在细菌发生变异以及某些基因发生改变引起一些蛋白质改变才会导致生化反应的异常。

有研究表明,细菌性质改变首先会表现在其代谢物发生变化[5],本研究从代谢物成分观察了不同传代的细菌上清的组成。从研究结果来看,传代对于乙酸影响不大;而乳酸含量随着传代的增加有所上升,从第10代开始变化较明显,而乙酸与乳酸的比值在第10代后增加减小,这可能与双歧杆菌的繁殖增快而糖酵解增加有关。因此从双歧杆菌代谢物组成来看,传代10代以后在用于商业生产可能对药效学及药理学会有所影响。

对传代培养以后双歧杆菌DNA(G+C)mol%研究发现,传代对于青春双歧杆菌的DNA(G+C)mol%的影响不大,在传代15代时其(G+C)mol%均在双歧杆菌属正常值范围以内。说明(G+C)mol%不受菌龄的影响,也不受突变以外的生长条件等各种外界因素的影响,与细菌的表型特征结合可以初步的认为双歧杆菌的遗传型特征无明显改变。

文章来源：《中国药理学与毒理学杂志》 网址: http://www.zgylxydlxzz.cn/zonghexinwen/2020/1029/405.html